汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

2007年浙江省鼠类感染汉坦病毒监测及病毒分离

目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒（HV）情况和病毒型别,为肾综合征出血热（HFRS）防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺Hv抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero—E6细胞分离病毒,用HV单克隆荧光抗体鉴定分离株的型别。结果共捕获鼠形动物1129只,其中黑线姬鼠为优势种,鼠肺HV抗原阳性率为3．0％,鼠血标本IgG抗体阳性57份,阳性率8．0％。分离到6株汉滩（HTN）型病毒,其中来自黑线姬鼠5株,褐家鼠1株。结论浙江省存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,HV主要流行型别为HTN型。     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

东南沿海地区汉坦病毒的遗传进化分析

目的 对浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因进行比较.方法 收集浙江、福建省及上海市汉坦病毒部分M基因序列,应用Mega 4.0和DNAStar软件包进行系统发生分析,以邻位相连法(NJ)构建系统发生树,分析东南沿海地区浙江、福建省及上海市汉坦病毒的基因差异,分析采用1000个多序列组.结果 经对浙江、福建省及上海市若干株汉坦病毒基因的序列比较与系统进化分析,浙江省分离的同型别毒株的基因序列同源性高于福建省与上海市的分离毒株,而浙江省同地区分离株的核苷酸同源性更高,地区接近的分离株系统进化分支的分布也大部分更靠近.汉滩型病毒(HTNV)福建株的ZH53和汉城型病毒(SEOV)浙江建德株Gou3和ZJ5与本研究同型别的其他株及国际标准株的核苷酸同源性较低,分别为82.7％～86.3％和84.0％～85.3％,而且分别在HTNV和SEOV发生群中构成一独立分支.浙江省从田鼠中分离到SEOV,产生宿主“溢出”现象.结论 浙江、福建省及上海市东南沿海地区汉坦病毒的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性,显示出高度的地理聚集现象,浙江省建德地区和福建省分别存在SEOV和HTNV的特殊亚型病毒.     

2005 - 2017年邻近5省肾综合征出血热病毒演变规律与病原分子进化研究

目的 探索江苏、安徽、江西、浙江、福建这5个地理相邻的省份中重要虫媒传染病肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的病毒演化关系,为HFRS的预防提供理论依据。方法 根据以往疫情资料和疫区类型在这5省中选择14个HFRS疫区,应用分子流行病学方法全面、系统的研究该病的流行特征、时空演变规律和宿主与病原共进化关系等。结果 5个省份在地理上邻近,气候上属于亚热带和温带的过渡地区,为病毒宿主提供了良好的繁衍条件。黑线姬鼠和褐家鼠分别为汉坦病毒在野外和室内的主要传染源。通过构建系统发生树进行分析发现,从疫区鼠中分离的汉坦病毒（hantavirus,HV）基因与现有病毒有高度的同源性;研究HV基因时空演变规律与病原分子进化发现,汉滩型病毒（hantaan virus, HTNV）和汉城型病毒（seoul virus, SEOV）的基因差异和亲缘性主要表现为地区性。结论 江苏、安徽、江西、浙江、福建地区仍是肾综合征出血热汉滩型和汉城型的主要混合疫区,该研究结果可为我国丘陵地区的肾综合征出血热流行趋势预测及预防提供理论依据。